Quali informazioni fornisce il Southern blotting? Southern blotting in genetica molecolare. Peculiarità. Scopri cos'è il "Southern blotting" in altri dizionari
Altre tecnologie di trasferimento (blotting), come Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, utilizzano metodi simili, ma per rilevare RNA o proteine in un campione e prendono il nome dal metodo inventato da Southern. Poiché Southern blot prende il nome dallo scienziato, il termine è scritto con lettera maiuscola, mentre Western blot e Northern blot sono in minuscolo.
Metodo
- Le endonucleasi di restrizione tagliano il DNA ad alto peso molecolare in frammenti più piccoli.
- I frammenti di DNA vengono sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio per la separazione longitudinale.
- Nel caso in cui alcuni frammenti di DNA siano più lunghi di 15 kb, prima del trasferimento il gel viene trattato, ad esempio, con acido cloridrico, che provoca la depurazione del DNA e facilita il trasferimento alla membrana.
- Quando si utilizza il metodo di trasferimento alcalino, il gel di agarosio viene posto in una soluzione alcalina, che denatura la doppia elica del DNA e facilita il legame del DNA caricato negativamente con la membrana caricata positivamente per un'ulteriore ibridazione. In questo caso, anche l’RNA rimanente viene distrutto.
- Un foglio di membrana di nitrocellulosa (o nylon) viene posto sopra o sotto il gel di agarosio. La pressione viene applicata direttamente al gel o attraverso diversi strati di carta. Per un trasferimento efficace è necessario uno stretto contatto tra il gel e la membrana. Il tampone viene trasportato dalle forze capillari da un'area ad alto contenuto di acqua a un'area a basso contenuto di acqua (membrana). Ciò comporta il trasferimento del DNA dal gel alla membrana. Il DNA polianionico si lega alla membrana caricata positivamente attraverso interazioni di scambio ionico.
- Per fissare definitivamente il DNA sulla membrana, quest'ultima viene riscaldata sotto vuoto ad una temperatura di 80 °C per due ore o illuminata radiazione ultravioletta(in caso di membrane in nylon).
- L'ibridazione di un campione marcato in modo radioattivo (fluorescente) con una sequenza di DNA nota viene effettuata con una membrana.
- Dopo l'ibridazione, il campione in eccesso viene lavato dalla membrana e i prodotti dell'ibridazione vengono visualizzati mediante autoradiografia (nel caso di un campione radioattivo) oppure viene valutato il colore della membrana (nel caso della colorazione cromogenica).
Risultati
L'ibridazione di un campione con una specifica regione di DNA fissata alla membrana indica la presenza della sequenza nucleotidica analizzata nel campione.
Applicazione
Per determinare numeri di copie del gene nel genoma. Una sonda che si ibrida solo su un singolo frammento di DNA che non è stato tagliato dagli enzimi di restrizione produrrà una singola banda su un Southern blot, mentre più bande sul blot indicano che la sonda si è ibridata su più sequenze identiche. I cambiamenti nelle condizioni di ibridazione (aumento della temperatura alla quale viene effettuata l'ibridazione, modifica della concentrazione di sale) portano ad un aumento della specificità e ad una diminuzione dell'ibridazione con sequenze vicine, ma non identiche.
Note
Vedi anche
- Assorbimento
- Northern blotting
Fondazione Wikimedia.
2010.
Scopri cos'è il "Southern blotting" in altri dizionari: Southernblotting
- Southern blotting Un metodo per rilevare sequenze nucleotidiche specifiche trasferendo frammenti di DNA separati elettrofreticamente da un gel di agarosio su un filtro di nitrocellulosa (carta) per effetto capillare... ... Southernblotting - - Argomenti biotecnologici EN Southern blotting ...
- Southern blotting Un metodo per rilevare sequenze nucleotidiche specifiche trasferendo frammenti di DNA separati elettrofreticamente da un gel di agarosio su un filtro di nitrocellulosa (carta) per effetto capillare... ...- Southern Blotting Southern blotting del campione di DNA. Il Southern blotting prevede la separazione elettroforetica del DNA e metodi per trasferire frammenti di DNA da un gel di agarosio ad una membrana sotto l'influenza di un campo elettrico per ulteriori analisi con... ... Esplicativo Dizionario inglese-russo sulle nanotecnologie. - M.
Southern blotting, Southern transfer Southern blotting, Southern blotting. Un metodo per rilevare sequenze nucleotidiche specifiche trasferendo frammenti di DNA separati elettrofreticamente da un gel di agarosio su una nitrocellulosa... ... Biologia molecolare e genetica. Dizionario.
BLOTTING DEL SUD- (Analisi Southern blot) un metodo per identificare forme specifiche di DNA nelle cellule. Le molecole di DNA vengono rimosse dalle cellule e separate in piccoli frammenti utilizzando enzimi di restrizione. Questi frammenti vengono separati gli uni dagli altri e con l'aiuto del gene... ... Dizionario esplicativo della medicina
Ibridazione Southern blot C blot- Southern blotting, ibridazione blot secondo S. * Southern blotting, ibridazione blot secondo S. * Southern blotting o S. ibridazione o tecnica S. transfer gel blotting (vedi), in cui i frammenti di DNA vengono separati per dimensione in un gel di agarosio ... ...
Un metodo per identificare forme specifiche di DNA nelle cellule. Le molecole di DNA vengono rimosse dalle cellule e separate in piccoli frammenti utilizzando enzimi di restrizione. Questi frammenti vengono separati gli uni dagli altri e viene effettuata una ricerca utilizzando una sonda genetica... ... Termini medici
Southern blotting Il Southern blotting è un metodo utilizzato in biologia molecolare per rilevare una sequenza specifica di DNA in un campione. Il metodo Southern blotting combina l'elettroforesi su gel di agarosio con... ... Wikipedia
- (dall'inglese Blot) un nome generale per i metodi di biologia molecolare per il trasferimento di determinate proteine o acidi nucleici da una soluzione contenente molte altre molecole su qualsiasi supporto (membrana di nitrocellulosa, PVDF o ... ... Wikipedia
Macchia di trasferimento macchiante- Blotting, blotting transfer * blotting, blotting transfer * blotting o blot transfer procedura per trasferire DNA separato elettroforeticamente (vedi), frammenti di DNA, RNA, frammenti di RNA o proteine da un gel (agarosio o poliacrilammide) a ... ... Genetica. Dizionario enciclopedico
Altre tecnologie di trasferimento (blotting), come Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, utilizzano metodi simili, ma per rilevare RNA o proteine in un campione e prendono il nome dal metodo inventato da Southern. Poiché Southern blot prende il nome dallo scienziato, il termine si scrive con la lettera maiuscola, mentre Western blot e Northern blot si scrivono con la lettera minuscola.
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Southern Blotting
Sottotitoli
Metodo
- Endonucleasi di restrizione per tagliare il DNA ad alto peso molecolare in frammenti più piccoli.
- I frammenti di DNA vengono sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio per la separazione longitudinale.
- Se alcuni frammenti di DNA sono più lunghi di 15 kb, prima del trasferimento il gel viene trattato, ad esempio, con acido cloridrico, che provoca la depurazione del DNA e facilita il trasferimento alla membrana.
- Quando si utilizza il metodo di trasferimento alcalino, il gel di agarosio viene posto in una soluzione alcalina, che denatura la doppia elica del DNA e facilita il legame del DNA caricato negativamente con la membrana caricata positivamente per un'ulteriore ibridazione. In questo caso, anche l’RNA rimanente viene distrutto.
- Un foglio di membrana di nitrocellulosa (o nylon) viene posto sopra o sotto il gel di agarosio. La pressione viene applicata direttamente al gel o attraverso diversi strati di carta. Per un trasferimento efficace è necessario uno stretto contatto tra il gel e la membrana. Il tampone viene trasportato dalle forze capillari da un'area ad alto contenuto di acqua a un'area a basso contenuto di acqua (membrana). Ciò comporta il trasferimento del DNA dal gel alla membrana. Il DNA polianionico si lega alla membrana caricata positivamente attraverso interazioni di scambio ionico.
- Per fissare definitivamente il DNA sulla membrana, questa viene riscaldata sotto vuoto ad una temperatura di 80 °C per due ore o illuminata con radiazioni ultraviolette (nel caso delle membrane di nylon).
- L'ibridazione di un campione marcato in modo radioattivo (fluorescente) con una sequenza di DNA nota viene effettuata con una membrana.
- Dopo l'ibridazione, il campione in eccesso viene lavato dalla membrana e i prodotti dell'ibridazione vengono visualizzati mediante autoradiografia (nel caso di un campione radioattivo) oppure viene valutato il colore della membrana (nel caso di colorazione cromogenica).
Risultati
L'ibridazione di un campione con una specifica regione di DNA fissata alla membrana indica la presenza della sequenza nucleotidica analizzata nel campione.
Applicazione
Per determinare numeri di copie del gene nel genoma. Una sonda che si ibrida solo su un singolo frammento di DNA che non è stato tagliato dagli enzimi di restrizione produrrà una singola banda su un Southern blot, mentre più bande sul blot indicano che la sonda si è ibridata su più sequenze identiche. I cambiamenti nelle condizioni di ibridazione (aumento della temperatura alla quale viene effettuata l'ibridazione, modifica della concentrazione di sale) portano ad un aumento della specificità e ad una diminuzione dell'ibridazione con sequenze vicine, ma non identiche.
Il blotting (letteralmente - blotting) è il trasferimento di frammenti di macromolecole (DNA, RNA o proteine), separati mediante elettroforesi su gel, su un supporto solido: una membrana. Negli studi sul genoma umano viene spesso utilizzato il metodo blotting sviluppato da Southern, in cui una sonda oligonucleotidica in soluzione viene ibridata con il DNA adsorbito su una membrana (ibridazione Southern blot). Il DNA genomico (solitamente isolato da leucociti o cellule fetali) viene tagliato in brevi frammenti, separato su un gel di agarosio, trasferito su una membrana e quindi regioni specifiche vengono identificate mediante ibridazione con sonde oligonucleotidiche (Fig. 65.6). Questo metodo identifica frammenti di DNA unici, la cui dimensione è circa un milionesimo del genoma.
L'importanza del metodo per la medicina è dovuta alla capacità di studiare un determinato frammento di DNA genomico in qualsiasi persona.
Il metodo viene utilizzato per rilevare ampi riarrangiamenti nel DNA e alcune mutazioni puntiformi (la maggior parte delle mutazioni puntiformi non può essere rilevata con questo metodo).
La denaturazione del DNA viene effettuata con alcali. Una volta completata l'elettroforesi, il gel viene posto in una soluzione basica (alcalina), in cui i frammenti di DNA a doppio filamento perdono i loro legami e diventano a filamento singolo.
Il trasferimento del DNA dal gel ad un filtro di nitrocellulosa o nylon viene effettuato in una soluzione tampone. Un filtro e una risma di carta da filtro vengono posti direttamente sulla superficie del gel. A causa dell'effetto capillare, viene creata una corrente tampone perpendicolare al piano del gel. Il DNA lavato via dal gel viene trattenuto dal filtro e finisce quasi completamente sulla sua superficie. Dopo il trasferimento, i fili a filamento singolo vengono fissati sul filtro. La posizione dei frammenti sul filtro corrisponde esattamente alla loro posizione nel gel. 3. Per identificare visivamente i frammenti richiesti (il DNA fissato sul filtro non è visibile), l'ibridazione viene effettuata con una sequenza nucleotidica specifica marcata con radionuclidi o un marcatore fluorescente, una sonda sintetica oligonucleotidica (tale sonda è composta da 16- 30 paia di basi) o un frammento di DNA clonato. La sequenza nucleotidica della sonda deve essere completamente o parzialmente complementare alla regione del DNA genomico studiata.
Quando il filtro viene incubato con una soluzione contenente una sonda marcata, avviene l'ibridazione dei filamenti di DNA complementari della sonda e del frammento sul filtro. Le molecole della sonda legate aspecifiche vengono lavate via utilizzando una procedura speciale.
Le aree radioattivamente marcate vengono rilevate esponendo un filtro alla pellicola radiografica (autoradiografia). Dopo lo sviluppo, sulla pellicola sono visibili bande di DNA marcato con la sonda.
Le etichette non radioattive vengono visualizzate mediante fluorescenza o indirettamente mediante anticorpi.
Quindi: l'ibridazione Southern blot è un metodo per analizzare la struttura di una determinata regione del genoma, basato su:
2) separare la pluralità dei frammenti risultanti mediante elettroforesi in una piastra piana di agarosio o altro gel;
3) trasferire i prodotti della separazione su un foglio di materiale poroso, ad esempio su un filtro di nitrocellulosa, in modo tale che tutti i frammenti di DNA vengano trasferiti sul filtro e fissati su di esso, creando un'impronta identica alla distribuzione dei frammenti nel gel dopo la separazione;
4) ibridazione del filtro con un frammento (sonda) di DNA o RNA marcato radioattivamente o con colorante, che in sequenza corrisponde alla regione del genoma analizzato. Di conseguenza, il campione, a causa di interazioni complementari, si lega a quelle parti del filtro in cui si trovano i frammenti del genoma oggetto di studio e la posizione di questi frammenti è identificata dalla posizione del tag del campione sul filtro.
E come accennato in precedenza, con l'aiuto dell'ibridazione Southern blot è possibile determinare l'identità o la differenza nella lunghezza dei frammenti (polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione, RFLP) ottenuta mediante scissione di restrizione dello stesso locus in diversi genomi confrontati.
Per identificare un gene, la molecola di DNA del genoma viene divisa utilizzando enzimi di restrizione in pezzi di circa 15-20 mila coppie di nucleotidi. Il genoma così suddiviso viene sottoposto a frazionamento elettroforetico in gel di agarosio. Le frazioni di DNA vengono poi denaturate dal calore e trasferite dal gel di agarosio ad un filtro di nitrocellulosa, dove vengono immobilizzate. Il processo di trasferimento del DNA assomiglia a bagnarsi (in inglese - assorbente) ed è chiamato metodo Southernblotting. L'essenza del blotting è che un gel di agarosio viene posto su carta da filtro imbevuta di una soluzione salina concentrata; un filtro di nitrocellulosa viene quindi posto sopra il gel e sopra viene posta carta da filtro asciutta. La soluzione salina viene assorbita nella carta asciutta; perché ciò avvenga deve passare attraverso un gel di agarosio e poi attraverso un filtro di nitrocellulosa. Il DNA viene trasferito con la soluzione, ma viene trattenuto dalla nitrocellulosa. Il DNA immobilizzato in questo modo può essere ibridare in posizione con una sonda radioattiva. Solo i frammenti ad esso complementari si ibrideranno con una sonda specifica. Poiché la sonda è radioattiva, l'ibridazione può essere rilevata mediante autoradiografia. Ciascuna sequenza complementare appare come una banda radioattiva, la cui posizione è determinata dalla dimensione del frammento di DNA. Uno schema del metodo Southern blotting è mostrato in Fig. 12.4.
Riso. 12.4. Schema Southern blotting: scissione del DNA del genoma utilizzando enzimi di restrizione in pezzi di 15.000-20.000 coppie di nucleotidi; separazione elettroforetica di questi enzimi di restrizione in gel di agarosio, trasferimento su filtro di nitrocellulosa, ibridazione con sonda a DNA e rilevazione delle molecole ibride risultanti mediante autoradiografia; *) schema di trasferimento (blotting).
Il metodo blotting è altamente sensibile e accurato ed è ampiamente utilizzato in medicina legale, medicina e veterinaria. Attualmente, il metodo di ibridazione molecolare è stato sviluppato per la diagnosi di malattie infettive degli animali da allevamento, ad esempio per rilevare l'agente eziologico di antrace, brucellosi, tubercolosi, afta epizootica, peste suina, peste aviaria, enterovirus, ecc. . Questo metodo è promettente per studiare le qualità riproduttive degli animali. Presenta vantaggi rispetto al metodo di studio dei marcatori di polimorfismo proteico attualmente accettato nell'allevamento.
Si ritiene che il metodo di ibridazione del DNA possa essere utilizzato con successo nella selezione dei tori, poiché il genoma del toro può essere diviso in geni, che vengono successivamente rilevati mediante blotting. In questo caso è necessario isolare circa 75 frammenti di DNA per valutare il genoma per la produzione del latte.
IN ultimi anniÈ in fase di sviluppo un nuovo metodo di analisi del DNA, il cosiddetto “impronta digitale genomica”. L'impronta digitale genomica comprende le seguenti fasi: isolamento del DNA, frammentazione mediante enzimi di restrizione, frazionamento mediante elettroforesi su gel. I frammenti di DNA contenenti regioni ipervariabili vengono rilevati utilizzando una sonda speciale - "Campioni di Jeffrey" a cui si legano per ibridazione. Le aree di ibridazione vengono identificate mediante autoradiografia.
La ricerca ha dimostrato che con questa tecnica il DNA isolato dal batteriofago Ml3 può essere utilizzato come sonda radioattiva. Il DNA di questo batteriofago contiene un altro tipo di sequenza ipervariabile, che si trova anche nel genoma umano. Il principio della struttura di questa sequenza ipervariabile è generalmente simile alla struttura del DNA minisatellite di Jeffreys. L'uso di questo nuovo campione per l'impronta genetica ha dimostrato la sua elevata efficienza e idoneità a risolvere molti problemi. Il fatto è che queste sequenze ipervariabili si trovano in vari rappresentanti della natura vivente: esseri umani, animali, piante e batteri, e quindi la sonda DNA del batteriofago M13 può essere utilizzata su larga scala. Ad esempio, per l'identificazione personale, per stabilire la parentela di eventuali esseri viventi. Il metodo consente di risolvere problemi di genetica e selezione degli animali, per selezionare tratti utili; Utilizzando questo metodo è possibile effettuare la certificazione genetica di singoli animali altamente produttivi, analizzarne il pedigree e utilizzare le informazioni ottenute per una selezione mirata.
Esiste un altro tipo di analisi dell'ibridazione del DNA: questo è il metodo dell'ibridazione puntuale (punto) (Fig. 9), che viene eseguita introducendo i campioni di DNA in esame in uno stato denaturato sul nylon filtri a membrana sotto forma di punti. Ad esempio (Fig. 12.5), il DNA del micobatterio tubercolare bovino in una quantità di 3 μl (1,8 μg/ml) sotto forma di punti viene applicato su quadrati (1,5 x 1,5 cm).
Riso. 12.5. Ibridazione a punti della sonda DNA di M.bovis: A: 1 - M.bovis: 2,3, - DNA da tessuto affetto da tubercolosi; B: 1,2,3 - DNA isolato da tessuti di animali sani; C: 1 - DNA dell'agente eziologico della brucellosi;
2 - DNA dell'agente patogeno Listeria;
3 - DNA del M. fortuitum.
Le molecole di DNA a filamento singolo (denaturate) vengono adsorbite sulla membrana e fissate. Successivamente, al filtro viene applicata una sonda di DNA marcata con fosforo radioattivo, cioè una molecola di M. bovis a filamento singolo etichettata P 32. Poiché in questo caso le basi azotate delle molecole di DNA di M. bovis e della sonda di DNA marcata con P 32 sono complementari, le basi azotate dei filamenti di DNA e della sonda di DNA sono legate a formare una doppia elica. Successivamente, le molecole sonda di DNA non legate vengono lavate via e le molecole ibride risultanti vengono rilevate mediante autoradiografia.
Una volta separati, il DNA, l'RNA o le proteine devono essere trasferiti su un supporto solido per il rilevamento e altre operazioni difficili da eseguire in un gel. Il processo di trasferimento che porta a immobilizzazione delle molecole , cioè. fissato in uno stato stazionario viene chiamato blotting (in inglese - blotting ). Come substrato vengono utilizzate membrane in nylon o nitrocellulosa.
Assorbimento(dall'inglese blotting - blotting) è un metodo per trasferire frammenti di DNA elettroforetico su uno speciale film (membrana) di nitrocellulosa che lega (immobilizza) molecole di DNA a filamento singolo.
Scopri cos'è il "Southern blotting" in altri dizionari:(dal nome dell'autore che lo ha proposto) si basa sul movimento dei frammenti di DNA per effetto capillare. Il processo di trasferimento dei frammenti di DNA contenuti in un gel di agarosio su una pellicola di nitrocellulosa utilizzando carta da filtro è simile al blotting.
L’analisi viene effettuata come segue:
– Il DNA isolato, purificato, denaturato e frammentato viene posto su un foglio di gel di agarosio, dove i frammenti vengono separati elettroforeticamente in base alla massa e alla carica.
– Un foglio di gel di agarosio viene posto su carta da filtro inumidita con una soluzione salina concentrata (tampone).
– Quindi viene applicato un filtro di nitrocellulosa al gel, dove avviene l’immobilizzazione (o l’adsorbimento o la fissazione) dei frammenti di DNA a filamento singolo.
– Sopra il filtro viene posizionata una pila di fogli di carta da filtro asciutta, che garantisce un flusso lento della soluzione tampone attraverso il gel (funge cioè come una sorta di pompa capillare). La soluzione salina, passando attraverso il gel di agarosio, porta con sé frammenti di DNA, che vengono trattenuti e legati dalla nitrocellulosa, e la soluzione viene assorbita dalla carta da filtro asciutta.
– Successivamente, il DNA viene denaturato con alcali e il filtro viene mantenuto sotto vuoto a una temperatura di 80 0 C, in seguito alla quale i frammenti di DNA a filamento singolo vengono immobilizzati (fissati) in modo irreversibile sulla nitrocellulosa. In questo caso la posizione delle bande di DNA immobilizzate corrisponde esattamente alla loro posizione nel gel.
– Il DNA legato al filtro viene posto in una soluzione con una sonda marcata con DNA, nella quale avviene l'ibridazione. Solo i frammenti di DNA complementari ad esso si ibrideranno (formano legami idrogeno) con una sonda specifica, che può essere rilevata come strisce chiare sulla pellicola radiografica, ad es. autoradiografia di un filtro di nitrocellulosa
Macchia di punti. Per preparare i dot blot, una preparazione di DNA o RNA viene applicata direttamente sul filtro. Le goccioline del farmaco sembrano punti sul filtro, il che spiega il nome del tipo di blotting (punto inglese). 1) Dal DNA genomico pretrattato con ultrasuoni si formano frammenti lunghi 5-10 coppie di nucleotidi.
2) Per rendere accessibili alla sonda le sonde di DNA o RNA, queste devono essere denaturate, cioè convertire in forma a catena singola. Ciò avviene sotto l'influenza di una temperatura di 100 °C.
3) Gli acidi nucleici denaturati vengono incubati su ghiaccio: un rapido abbassamento della temperatura impedisce la loro rinaturazione, cioè accoppiamento complementare di catene. Il DNA o RNA denaturato viene applicato direttamente al filtro, che viene incubato in una soluzione contenente la sonda.
4) Per evitare che l'acido nucleico analizzato vada in soluzione, è necessario fissarlo su un filtro (membrana). Per questo vengono utilizzati due tipi di filtri: nitrocellulosa e nylon.
Per immobilizzare gli acidi nucleici su un filtro di nitrocellulosa, si utilizza la frittura a 80 °C sotto vuoto e su un filtro di nylon si utilizza l'irradiazione UV per 3-5 minuti.
5) Dopo l'incubazione del preparato di acido nucleico con una sonda marcata con isotopi, viene eseguita l'autoradiografia in un'apposita cassetta o l'identificazione mediante metodi non radioattivi.
Il dot blotting consente di rispondere a una sola domanda: se la sequenza nucleotidica desiderata è presente in un dato campione.
Analisi Northern blot si applica:
1) isolare e analizzare l'RNA (ad esempio, per determinare se l'mRNA letto da un dato gene è presente in un dato tipo di cellula, cioè se il gene è espresso o meno;
2) determinare la quantità di questo RNA e i suoi cambiamenti nello sviluppo di un dato tipo di cellula;
3) per determinare la dimensione di una trascrizione di un gene.
In questo caso, le molecole di RNA isolate dalla cellula vengono separate per dimensione mediante elettroforesi su gel e quindi trasferite su un filtro. Dopo l'ibridazione con una sonda a filamento singolo marcata, vengono identificati i siti di ibridazione (omologia) dell'RNA e della sonda.
Se non si conosce la sequenza nucleotidica del gene (o mRNA) desiderato, ma si conosce la proteina di cui controlla la sintesi, allora è possibile isolare una piccola quantità di proteina pura e determinare la sequenza aminoacidica di alcune di essa (conoscenza sono sufficienti 5-6 residui aminoacidici). Utilizzando la tabella dei codici genetici è possibile stabilire tutte le possibili sequenze nucleotidiche nella sezione dell'mRNA (o del gene stesso) che codifica una determinata sequenza aminoacidica. In questo caso, è possibile sintetizzare una sonda per cercare i cloni desiderati in una libreria genetica.
Blottina occidentaleG(immunoelectroblotting, protein blotting) è un metodo per identificare proteine uniche. Si basa sul fenomeno dell’interazione antigene-anticorpo altamente specifica. Pertanto, l'antigene (bersaglio) è la proteina da determinare e la sonda è l'anticorpo contro di essa.
Si ottengono anticorpi contro la proteina in studio in vari modi. Il metodo più semplice consiste nell'iniettare un campione proteico purificato nel flusso sanguigno di un animale da laboratorio (solitamente un coniglio). Il suo corpo produce anticorpi (immunoglobuline) contro questa proteina estranea. Questi sono anticorpi primari che interagiranno con la proteina bersaglio.
Tuttavia, non sarebbe pratico introdurre un’etichetta identificativa direttamente nei dati sugli anticorpi. Il rilevamento di proteine diverse richiederebbe l'etichettatura di anticorpi diversi, il che comporterebbe costi elevati. Si è rivelato più ragionevole da usare anticorpi universali – antiimmunoglobuline coniugate, che sono essenzialmente anticorpi contro anticorpi prodotti utilizzando la proteina identificata come antigene. Ad esempio, le anti-immunoglobuline coniugate alle Ig di coniglio interagiranno con tutte le immunoglobuline sintetizzate nei conigli con antigeni diversi. Pertanto, sono proprio questi anticorpi secondari universali a portare un'etichetta isotopica o non radioattiva. Oltre ad un marcatore non isotopico, che nel corso di numerose reazioni porta alla formazione di un composto colorato insolubile (come nel caso del blotting degli acidi nucleici), un marcatore chemiluminescente, che ha una sensibilità maggiore, è molto spesso usato.
1) Estrazione delle proteine dall'omogenato
2) Separazione delle proteine in base al peso molecolare mediante elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide (PAGE). Il metodo dell'elettroforesi SDS prevede la denaturazione delle proteine native. Pertanto, le molecole proteiche con lo stesso peso molecolare percorreranno lo stesso percorso nel gel e si allineeranno sotto forma di una striscia. Poiché la miscela contiene molecole proteiche dimensioni diverse, si formano molte strisce. I risultati dell'elettroforesi possono essere visualizzati mediante colorazione delle proteine (colorazione blu brillante Coomassie, nero amido, argento). La colorazione con argento ha una sensibilità unica che consente il rilevamento di appena 0,1 ng di proteine nella banda risultante. Questo è molto importante per controllare la quantità di proteine applicate al gel.
3) Trasferimento delle proteine dal gel alla membrana. Ciò avviene perché la poliacrilammide non consente alle grandi molecole di immunoglobuline di diffondersi nella proteina. E la proteina immobilizzata sulla membrana diventa accessibile agli anticorpi. A differenza del blotting degli acidi nucleici, il trasferimento delle proteine alla membrana avviene sotto l'influenza di forze elettriche, ad es. in un campo elettrico.
4) La macchia risultante viene incubata con antisiero contro la proteina e quindi con antiimmunoglobuline. Il risultato viene visualizzato in base al tipo di etichetta utilizzata.
Restrizioni:
1) le grandi dimensioni dei frammenti oggetto di studio, che superano significativamente la lunghezza delle sonde di DNA e impediscono l'analisi molecolare diretta;
2) l'impossibilità di scegliere arbitrariamente le estremità delle sequenze studiate, determinata dalla presenza di corrispondenti siti di restrizione nella molecola di DNA originale;
3) la necessità di una grande quantità di DNA genomico ad alto peso molecolare ben purificato (almeno 10 μg per reazione, che equivale a 0,5-1 ml di sangue),
4) per l'ibridazione genomica - la presenza di sonde di DNA radioattivo con elevata attività specifica di almeno 109 impulsi/min * µg), funzionanti per un periodo di tempo limitato, e un'unità isotopica appositamente attrezzata. Inoltre, l'esposizione prolungata degli autografi allunga notevolmente i tempi per ottenere risultati.
5) alta intensità di lavoro ricerca