איזה מידע מספק סימון דרום? סיכה דרומית בגנטיקה מולקולרית. מוזרויות. ראה מה זה "סימון דרום" במילונים אחרים

כתם דרומי) היא טכניקה המשמשת בביולוגיה מולקולרית כדי לזהות רצף DNA ספציפי בדגימה. סיכה דרומית משלבת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לשבור DNA עם טכניקות להעברת DNA מופרד באורך על גבי מסנן ממברנה להכלאה. השיטה קרויה על שם הממציא שלה, הביולוג האנגלי אדווין סאות'רן.

טכנולוגיות העברה (בליטות) אחרות, כמו Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, משתמשות בשיטות דומות, אך כדי לזהות RNA או חלבון בדגימה, ונקראות על שם השיטה שהמציא Southern. מכיוון שכתם דרומית נקראת על שם המדען, המונח נכתב עם אות גדולה, בעוד כתם מערבי וכתמה צפונית הם אותיות קטנות.

שִׁיטָה

1. אנדונוקלאזים של הגבלה חותכים DNA במשקל מולקולרי גבוה לשברים קטנים יותר.
2. שברי ה-DNA עוברים אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז להפרדה לאורך.
3. במקרה שחלקי DNA ארוכים מ-15 kb, לפני ההעברה הג'ל מטופל, למשל, בחומצה הידרוכלורית, הגורמת לדהפורינציה של ה-DNA ומקלה על העברה לממברנה.
4. כאשר משתמשים בשיטת ההעברה הבסיסית, מניחים את ג'ל האגרוז בתמיסה אלקלית, אשר מנטרלת את הסליל הכפול של ה-DNA ומקלה על הקישור של ה-DNA הטעון השלילי לממברנה הטעונה חיובית להמשך הכלאה. במקרה זה, גם ה-RNA שנותר מושמד.
5. יריעה של קרום ניטרוצלולוזה (או ניילון) מונח על גבי או תחתית הג'ל אגרוז. לחץ מופעל ישירות על הג'ל או דרך מספר שכבות נייר. להעברה מוצלחת, יש צורך במגע הדוק בין הג'ל לממברנה. החיץ מועבר על ידי כוחות נימיים מאזור עם תכולת מים גבוהה לאזור עם תכולת מים נמוכה (ממברנה). זה כולל העברת DNA מהג'ל לממברנה. DNA פוליאוני נקשר לממברנה הטעונה חיובית באמצעות אינטראקציות חילופי יונים.
6. כדי לקבע סוף סוף את ה-DNA על הממברנה, זה האחרון מחומם בוואקום לטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או מואר. קרינה אולטרה סגולה(במקרה של ממברנות ניילון).
7. הכלאה של דגימה מסומנת רדיואקטיבית (פלורסנטית) עם רצף DNA ידוע מתבצעת עם ממברנה.
8. לאחר ההכלאה, דגימה עודפת נשטפת מהממברנה ותוצרי ההכלאה מוצגים באמצעות אוטורדיוגרפיה (במקרה של דגימה רדיואקטיבית) או מוערך צבע הממברנה (במקרה של צביעה כרומוגנית).

תוצאות

הכלאה של דגימה עם אזור DNA ספציפי מקובע לממברנה מעידה על נוכחות רצף הנוקלאוטידים המנותח בדגימה.

בַּקָשָׁה

ניתן להשתמש בסוטה דרומית, המבוצעת עם DNA גנומי שטופל באנדונוקליזות הגבלה, כדי לקבוע מספרי העתק גניםבגנום. בדיקה שמכליאה רק למקטע DNA בודד שלא נחתך על ידי אנזימי הגבלה תייצר פס בודד על כתם דרום, בעוד שמספר פסים על הכתם מצביעים על הכלאה של הבדיקה למספר רצפים זהים. שינויים בתנאי הכלאה (הגדלת הטמפרטורה בה מתבצע ההכלאה, שינוי ריכוז המלחים) מביאים לעלייה בספציפיות ולירידה בהכלאה עם רצפים קרובים, אך לא זהים.

הערות

ראה גם

• סופג
• סופג צפוני

קרן ויקימדיה.

2010.

ראה מה זה "סימון דרום" במילונים אחרים:סיכה דרומית

- Southern blotting שיטה לזיהוי רצפי נוקלאוטידים ספציפיים על ידי העברת שברי DNA מופרדים באלקטרופרטית מג'ל אגרוז על גבי מסנן ניטרוצלולוזה (נייר) עקב האפקט הנימים... ...סיכה דרומית - - נושאי ביוטכנולוגיה EN Southern blotting ...

- Southern blotting שיטה לזיהוי רצפי נוקלאוטידים ספציפיים על ידי העברת שברי DNA מופרדים באלקטרופרטית מג'ל אגרוז על גבי מסנן ניטרוצלולוזה (נייר) עקב האפקט הנימים... ...- Southern Blotting סיכה דרומית של דגימת DNA. סיכה דרומית כוללת הפרדה אלקטרופורטית של DNA ושיטות להעברת שברי DNA מג'ל אגרוז לממברנה בהשפעת שדה חשמלי לצורך ניתוח נוסף עם... ... מַסבִּיר מילון אנגלי-רוסיעל ננוטכנולוגיה. - מ.

סופג דרום, העברה דרומית סופג דרום, סופג דרום. שיטה לאיתור רצפי נוקלאוטידים ספציפיים על ידי העברת שברי DNA מופרדים אלקטרופרטית מג'ל אגרוז על גבי ניטרוצלולוזה... ... ביולוגיה מולקולרית וגנטיקה. מילון.

סאות'רן BLOTTING- (ניתוח הכתם הדרומי) שיטה לזיהוי צורות ספציפיות של DNA בתאים. מולקולות DNA מוסרות מהתאים ומופרדות לשברים קטנים באמצעות אנזימי הגבלה. השברים הללו מופרדים זה מזה, ובעזרת הגן... ... מילון הסבר לרפואה

הכלאה של כתם דרומית C- סיכה דרומית, הכלאת כתמים לפי S. * ספיגת כתמים דרומית, הכלאת כתמים לפי S. * טכניקת סיכה דרומית או S. הכלאה או טכניקת S. transfer gel blotting (ראה), בה מפרידים שברי DNA לפי גודל בג'ל אגרוז. ... ...

שיטה לזיהוי צורות ספציפיות של DNA בתאים. מולקולות DNA מוסרות מהתאים ומופרדות לשברים קטנים באמצעות אנזימי הגבלה. הפרגמנטים הללו מופרדים זה מזה, וחיפוש מתבצע באמצעות בדיקה גנטית... ... מונחים רפואיים

Southern blotting Southern blotting היא שיטה המשמשת בביולוגיה מולקולרית כדי לזהות רצף DNA ספציפי בדגימה. שיטת ה-Southern blotting משלבת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ל... ... ויקיפדיה

- (מה-Blot האנגלית) השם הכללי לשיטות ביולוגיה מולקולרית להעברת חלבונים או חומצות גרעין מסוימות מתמיסה המכילה מולקולות רבות אחרות אל כל נשא (ממברנה ניטרוצלולוזה, PVDF או ... ... ויקיפדיה

ספיגת העברה סופג- העברת כתמים, העברת כתמים * העברת כתמים, העברת כתמים * הליך העברת כתמים להעברת DNA מופרד אלקטרופורטית (ראה), שברי DNA, RNA, שברי RNA או חלבונים מג'ל (אגרוז או פוליאקרילאמיד) ל... ... גנטיקה. מילון אנציקלופדי

כתם דרומית היא שיטה המשמשת בביולוגיה מולקולרית לזיהוי רצף DNA ספציפי בדגימה. שיטת ה-Southern blot משלבת אלקטרופורזה של ג'ל agarose לחלוקה של DNA עם טכניקות להעברת DNA מופרד באורך על גבי מסנן ממברנה להכלאה. השיטה קרויה על שם הממציא שלה, הביולוג האנגלי אדווין סאות'רן.

טכנולוגיות העברה (בליטות) אחרות, כמו Western blotting, Northern blotting, Southern blotting, משתמשות בשיטות דומות, אך כדי לזהות RNA או חלבון בדגימה, ונקראות על שם השיטה שהמציא Southern. מכיוון שכתם דרומית נקראת על שם המדען, המונח נכתב באות גדולה, בעוד כתם מערבי וכתם צפוני נכתבים באות קטנה.

יוטיוב אנציקלופדית

1 / 1

סימון דרום

כתוביות

שִׁיטָה

1. אנדונוקליזות הגבלה לחיתוך DNA במשקל מולקולרי גבוה לשברים קטנים יותר.
2. שברי ה-DNA עוברים אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז להפרדה לאורך.
3. אם חלק מקטעי ה-DNA ארוכים מ-15 קילובייט, לפני ההעברה הג'ל מטופל, למשל, בחומצה הידרוכלורית, הגורמת לדפורינציה של ה-DNA ומקלה על העברה לממברנה.
4. כאשר משתמשים בשיטת ההעברה הבסיסית, מניחים את ג'ל האגרוז בתמיסה אלקלית, אשר מנטרלת את הסליל הכפול של ה-DNA ומקלה על הקישור של ה-DNA הטעון השלילי לממברנה הטעונה חיובית להמשך הכלאה. במקרה זה, גם ה-RNA שנותר מושמד.
5. יריעה של קרום ניטרוצלולוזה (או ניילון) מונח על גבי או תחתית הג'ל אגרוז. לחץ מופעל ישירות על הג'ל או דרך מספר שכבות נייר. להעברה מוצלחת, יש צורך במגע הדוק בין הג'ל לממברנה. החיץ מועבר על ידי כוחות נימיים מאזור עם תכולת מים גבוהה לאזור עם תכולת מים נמוכה (ממברנה). זה כולל העברת DNA מהג'ל לממברנה. DNA פוליאוני נקשר לממברנה הטעונה חיובית באמצעות אינטראקציות חילופי יונים.
6. כדי לקבע סופית את ה-DNA על הממברנה, זה האחרון מחומם בוואקום לטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או מואר בקרינה אולטרה סגולה (במקרה של ממברנות ניילון).
7. הכלאה של דגימה מסומנת רדיואקטיבית (פלורסנטית) עם רצף DNA ידוע מתבצעת עם ממברנה.
8. לאחר ההכלאה, הדגימה העודפת נשטפת מהממברנה ותוצרי ההכלאה מוצגים באמצעות אוטורדיוגרפיה (במקרה של דגימה רדיואקטיבית) או מוערך צבע הממברנה (במקרה של צביעה כרומוגנית).

תוצאות

הכלאה של דגימה עם אזור DNA ספציפי מקובע לממברנה מעידה על נוכחות רצף הנוקלאוטידים המנותח בדגימה.

בַּקָשָׁה

ניתן להשתמש בסוטה דרומית, המבוצעת עם DNA גנומי שטופל באנדונוקליזות הגבלה, כדי לקבוע מספרי העתק גניםבגנום. בדיקה שמכליאה רק למקטע DNA בודד שלא נחתך על ידי אנזימי הגבלה תייצר פס בודד על כתם דרום, בעוד שמספר פסים על הכתם מצביעים על הכלאה של הבדיקה למספר רצפים זהים. שינויים בתנאי הכלאה (הגדלת הטמפרטורה בה מתבצע ההכלאה, שינוי ריכוז המלחים) מביאים לעלייה בספציפיות ולירידה בהכלאה עם רצפים קרובים, אך לא זהים.

ספיגה (פשוטו כמשמעו - סופג) היא העברה של שברי מקרומולקולות (DNA, RNA או חלבון), המופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל, על גבי תומך מוצק - ממברנה. במחקרים על הגנום האנושי, נעשה שימוש לעתים קרובות בשיטת הסופג שפותחה על ידי סאות'רן, שבה בדיקה אוליגונוקלאוטיד בתמיסה עוברת הכלאה עם DNA שנספג על גבי ממברנה (Southern blot hybridization). DNA גנומי (בדרך כלל מבודד מלוקוציטים או מתאי עובר) מבוקע לשברים קצרים, מופרדים בג'ל אגרוז, מועברים לממברנה, ולאחר מכן מזוהים אזורים ספציפיים באמצעות הכלאה עם בדיקות אוליגונוקלאוטידים (איור 65.6). שיטה זו מזהה שברי DNA ייחודיים, שגודלם הוא כמיליון מהגנום.

משמעות השיטה לרפואה נובעת מהיכולת לחקור קטע מסוים של DNA גנומי בכל אדם.

השיטה משמשת לאיתור סידורים גדולים ב-DNA ומוטציות נקודתיות מסוימות (לא ניתן לזהות את רוב המוטציות הנקודתיות בשיטה זו).

דנטורציה של DNA מתבצעת עם אלקלי. לאחר השלמת האלקטרופורזה, הג'ל מונח בתמיסת בסיס (אלקלי), שבה שברי DNA דו-גדילי מאבדים את הקשרים שלהם והופכים לחד-גדילים.

העברת DNA מהג'ל למסנן ניטרוצלולוזה או ניילון מתבצעת בתמיסת חיץ. מסנן וערימה של נייר סינון מונחים ישירות על פני הג'ל. בשל האפקט הקפילרי, נוצר זרם חוצץ בניצב למישור הג'ל. ה-DNA שנשטף מהג'ל נשמר על ידי המסנן ומסתיים כמעט לחלוטין על פני השטח שלו. לאחר ההעברה, החוטים החד-גדיליים קבועים על המסנן. מיקום השברים על המסנן תואם בדיוק את מיקומם בג'ל. 3. על מנת לזהות ויזואלית את השברים הנדרשים (DNA מקובע על המסנן אינו נראה), מבצעים הכלאה עם רצף נוקלאוטידים ספציפי המסומן ברדיונוקלידים או תווית פלואורסצנטית, בדיקה סינתטית אוליגונוקלאוטיד (בדיקה כזו מורכבת מ-16- 30 זוגות בסיסים), או קטע DNA משובט. רצף הנוקלאוטידים של הבדיקה חייב להיות משלים באופן מלא או חלקי לאזור ה-DNA הגנומי הנחקר.

כאשר מסנן מודגרת עם תמיסה המכילה בדיקה מסומנת, מתרחשת הכלאה של גדילי ה-DNA המשלימים של הבדיקה ושל הפרגמנט על המסנן. מולקולות בדיקה לא ספציפיות נשטפות באמצעות הליך מיוחד.

אזורים המסומנים רדיואקטיבית מזוהים על ידי חשיפת מסנן לסרט רנטגן (אוטורדיוגרפיה). לאחר הפיתוח, רצועות DNA המסומנות בבדיקה נראות על הסרט.

תוויות לא רדיואקטיביות מומחשות על ידי הקרינה או בעקיפין על ידי נוגדנים.

אז: הכלאה של הכתם הדרומי היא שיטה לניתוח המבנה של אזור גנום נתון, המבוססת על:

2) הפרדת ריבוי השברים שנוצרו באמצעות אלקטרופורזה בצלחת שטוחה של אגרוז או ג'ל אחר;

3) העברת תוצרי ההפרדה על גבי יריעת חומר נקבובי, למשל, על גבי מסנן ניטרוצלולוזה באופן שכל שברי ה-DNA מועברים למסנן ומתקבעים עליו, ויוצרים טביעה זהה לפיזור השברים בג'ל. לאחר הפרדה;

4) הכלאה של המסנן עם קטע DNA או RNA מסומן רדיואקטיבית או בצבע (probe), אשר ברצף מתאים לאזור הגנום המנותח. כתוצאה מכך, הדגימה, עקב אינטראקציות משלימות, נקשרת לאותם חלקים של הפילטר שבהם נמצאים קטעי הגנום הנבדקים, ומיקומם של קטעים אלו מזוהה לפי מיקום התג מהדגימה על המסנן.

וכאמור לעיל, בעזרת הכלאה של Southern blot ניתן לקבוע את הזהות או ההבדל באורכי הפרגמנטים (restriction fragment length polymorphism, RFLP) המתקבלים על ידי ביקוע הגבלה של אותו לוקוס בגנומים שונים בהשוואה.

כדי לזהות גן, מולקולת ה-DNA של הגנום מפוצלת באמצעות אנזימי הגבלה לחתיכות בגודל של כ-15-20 אלף זוגות נוקלאוטידים. פיצול הגנום בדרך זו נתון לפירוק אלקטרופורטי בג'ל אגרוז. לאחר מכן, חלקי ה-DNA עוברים דנטורציה בחום ומועברים מג'ל אגרוז למסנן ניטרוצלולוזה, שם הם משותקים. תהליך העברת ה-DNA דומה להירטב (באנגלית - סופג)ונקראת שיטה סיכה דרומית.המהות של סופג היא שג'ל אגרוז מונח על נייר סינון ספוג בתמיסת מלח מרוכזת; לאחר מכן מניחים מסנן ניטרוצלולוזה מעל הג'ל ומעליו מניחים נייר סינון יבש. תמיסת המלח נספגת בנייר היבש; כדי שזה יקרה, הוא חייב לעבור דרך ג'ל אגרוז ולאחר מכן דרך מסנן ניטרוצלולוזה. ה-DNA מועבר עם התמיסה, אך נשמר על ידי הניטרוצלולוזה. DNA מקובע בצורה זו יכול להיות לְהַכלִיאבמקום עם בדיקה רדיואקטיבית. רק פרגמנטים המשלימים לו יתכלאו עם בדיקה ספציפית. מכיוון שהבדיקה רדיואקטיבית, ניתן לזהות הכלאה באמצעות אוטורדיוגרפיה. כל רצף משלים מופיע כפס רדיואקטיבי, מיקומה נקבע לפי גודל שבר ה-DNA. תרשים של שיטת הספיגה הדרומית מוצג באיור. 12.4.

אוֹרֶז. 12.4. סכמת סיכה דרומית: ביקוע של DNA הגנום באמצעות אנזימי הגבלה לחתיכות של 15,000-20,000 זוגות נוקלאוטידים; הפרדה אלקטרופורטית של אנזימי הגבלה אלו בג'ל אגרוז, העברתם למסנן ניטרוצלולוזה, הכלאה עם בדיקת DNA וזיהוי מולקולות היברידיות שנוצרו על ידי אוטורדיוגרפיה; *) ערכת העברה (כתימה).

שיטת הספיגה רגישה ומדויקת ביותר ונמצאת בשימוש נרחב בזיהוי פלילי, ברפואה וברפואה וטרינרית. נכון להיום פותחה שיטת ההכלאה המולקולרית לאבחון מחלות זיהומיות של חיות משק, למשל, לאיתור הגורם הסיבתי של אנתרקס, ברוצלוזיס, שחפת, מחלת הפה והטלפיים, קדחת חזירים, מכת ציפורים, אנטרוווירוסים וכו'. . שיטה זו מבטיחה לחקר איכויות הרבייה של בעלי חיים. יש לו יתרונות על פני השיטה של ​​חקר סמני פולימורפיזם חלבון המקובל כיום בגידול.

מאמינים שניתן להשתמש בהצלחה בשיטת ההכלאה של DNA בבחירת שוורים, שכן ניתן לחלק את הגנום של השוורים לגנים, אשר מתגלים לאחר מכן באמצעות ספיגה. במקרה זה, יש צורך לבודד כ-75 שברי DNA כדי להעריך את הגנום לייצור חלב.

IN השנים האחרונותשיטה חדשה לניתוח DNA, מה שמכונה "טביעת אצבע גנומית", נמצאת בפיתוח. טביעת אצבע גנומית כוללת את השלבים הבאים: בידוד DNA, פיצול באמצעות אנזימי הגבלה, חלוקה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. שברי DNA המכילים אזורים היפר-משתנים מזוהים באמצעות בדיקה מיוחדת - "דגימות של ג'פרי"שאליו הם נקשרים בהכלאה. אזורי הכלאה מזוהים על ידי אוטורדיוגרפיה.

מחקרים הראו כי טכניקה זו יכולה להשתמש ב-DNA מבודד מהבקטריופאג Ml3 כבדיקה רדיואקטיבית. ה-DNA של בקטריופאג זה מכיל סוג נוסף של רצף היפר-משתנה, שנמצא גם בגנום האנושי. עקרון המבנה של רצף היפר-משתנה זה דומה בדרך כלל למבנה ה-DNA המיני-לווייני של ג'פריס. השימוש בדגימה חדשה זו לטביעת אצבע של גנים הראה את יעילותה הגבוהה והתאמתה לפתרון בעיות רבות. העובדה היא שרצפים היפר-משתנים אלה נמצאים בנציגים שונים של הטבע החי - בני אדם, בעלי חיים, צמחים וחיידקים, ולכן ניתן להשתמש בבדיקת ה-DNA בקטריופאג' M13 בקנה מידה רחב. למשל, לזיהוי אישי, כדי לבסס את הקרבה של כל יצור חי. השיטה מאפשרת לפתור בעיות של גנטיקה וברירת בעלי חיים, לבחור תכונות שימושיות; באמצעות שיטה זו ניתן לבצע הסמכה גנטית לבעלי חיים בודדים פרודוקטיביים, לנתח את אילן היוחסין ולהשתמש במידע המתקבל לבחירה ממוקדת.

קיים סוג נוסף של ניתוח הכלאה של DNA - זוהי שיטת הכלאה נקודתית (נקודה) (איור 9), המתבצעת על ידי החדרת דגימות ה-DNA הנבדקות במצב דנטורטי על ניילון מסנני ממברנהבצורה של נקודות. לדוגמה (איור 12.5), ה-DNA של Mycobacterium tuberculosis של בקר בכמות של 3 μl (1.8 μg/ml) בצורה של נקודות מוחל על ריבועים (1.5 x 1.5 ס"מ).

אוֹרֶז. 12.5. הכלאה של נקודות של בדיקה של M.bovis DNA: A: 1 - M.bovis: 2.3, - DNA מרקמות מושפעות שחפת; B: 1,2,3 - DNA מבודד מרקמות של בעלי חיים בריאים; C: 1 - DNA של הגורם הסיבתי של ברוצלוזיס;

2 - DNA של הפתוגן ליסטריה;

3 - M. fortuitum DNA.

מולקולות DNA חד-גדיליות (דנטורציות) נספגות על הממברנה ומקובעות. לאחר מכן, בדיקה DNA המסומנת בזרחן רדיואקטיבי, כלומר, מולקולת M. bovis חד-גדילית המסומנת P 32, מונחת על המסנן. מכיוון שבמקרה זה הבסיסים החנקניים של מולקולות ה-DNA M. bovis ו-Probe ה-DNA המסומן P 32 הם משלימים, הבסיסים החנקניים של גדילי ה-DNA ושל בדיקת ה-DNA קשורים ליצירת סליל כפול. לאחר מכן, מולקולות בדיקה של DNA שאינן קשורות נשטפות והמולקולות ההיברידיות המתקבלות מתגלות על ידי אוטורדיוגרפיה.

לאחר הפרדת DNA, RNA או חלבונים, יש להעביר אותם לתמיכה מוצקה לזיהוי ופעולות אחרות שקשה לבצע בג'ל. תהליך ההעברה המוביל ל אי מוביליזציה של מולקולות , כלומר קבוע במצב נייח נקרא סופג (באנגלית - סופג ). ממברנות ניילון או ניטרוצלולוזה משמשות כמצע.

סופג(מהאנגלית blotting - blotting) היא שיטה להעברת שברי DNA אלקטרופורטי על גבי סרט (ממברנה) מיוחד העשוי מניטרוצלולוזה הקושר (משתק) מולקולות DNA חד-גדיליות.

ראה מה זה "סימון דרום" במילונים אחרים:(על שם המחבר שהציע זאת) מבוסס על תנועה של שברי DNA עקב האפקט הנימים. התהליך של העברת שברי DNA הכלולים בג'ל אגרוז על גבי סרט ניטרוצלולוזה באמצעות נייר סינון דומה לספיגה.

הניתוח מתבצע באופן הבא:

- DNA מבודד, מטוהר, דנטורטי ומפוצל מונח על יריעת ג'ל אגרוז, כאשר השברים מופרדים אלקטרופורטית על ידי מסה ומטען.

– מניחים יריעת ג'ל אגרוז על נייר סינון המורטב בתמיסת מלח מרוכזת (חוצץ).

- לאחר מכן מוחל מסנן ניטרוצלולוזה על הג'ל, שם מתרחשת אימוביליזציה (או ספיחה או קיבוע) של שברי DNA חד-גדיליים.

– על גבי המסנן מונחת ערימה של יריעות של נייר סינון יבש, מה שמבטיח זרימה איטית של תמיסת החוצץ דרך הג'ל (כלומר, משמשת כמעין משאבה קפילרית). תמיסת המלוח, העוברת דרך הג'ל אגרוז, נושאת עמה שברי DNA, שנשמרים ונקשרים על ידי ניטרוצלולוזה, והתמיסה נספגת בנייר סינון יבש.

– לאחר מכן, ה-DNA עובר דנטורציה עם אלקלי, והפילטר נשמר בוואקום בטמפרטורה של 80 0 C, וכתוצאה מכך קטעי DNA חד-גדילי מקובעים (מקובעים) באופן בלתי הפיך על ניטרוצלולוזה. במקרה זה, המיקום של להקות ה-DNA המשומקות מתאים בדיוק למיקומן בג'ל.

– DNA הקשור למסנן מונח בתמיסה עם בדיקה מסומנת DNA, בה מתרחשת הכלאה. רק שברי DNA המשלימים לו יכלאו (יוצרים קשרי מימן) עם בדיקה ספציפית, שניתן לזהות כפסים בהירים על סרט רנטגן, כלומר. אוטורדיוגרפיה של מסנן ניטרוצלולוזה

כתם נקודה. להכנת נקודות כתמים, תכשיר DNA או RNA מוחל ישירות על המסנן. טיפות של התרופה נראות כמו נקודות על המסנן, מה שמסביר את שם סוג הספיגה (נקודה אנגלית). 1) מ-DNA גנומי שטופל מראש באולטרסאונד, נוצרים שברים באורך 5-10 זוגות נוקלאוטידים.

2) כדי להנגיש בדיקות DNA או RNA לבדיקה, יש לבצע דנטורציה, כלומר. להמיר לצורת שרשרת אחת. זה מתרחש בהשפעת טמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס.

3) חומצות גרעין דנטוריות מודגרות על קרח: ירידה מהירה בטמפרטורה מונעת את חידושן, כלומר. זיווג משלים של שרשראות. DNA או RNA דנטורטי מוחל ישירות על המסנן, אשר מודגרים בתמיסה המכילה את הבדיקה.

4) כדי למנוע מחומצת הגרעין המנותחת להיכנס לתמיסה, יש לקבע אותה על מסנן (ממברנה). לשם כך משתמשים בשני סוגים של מסננים: ניטרוצלולוזה וניילון.

כדי לשתק חומצות גרעין על מסנן ניטרוצלולוזה, משתמשים בטיגון ב-80 מעלות צלזיוס בוואקום, ובמסנן ניילון משתמשים בקרינת UV למשך 3-5 דקות.

5) לאחר דגירה של תכשיר חומצת הגרעין עם בדיקה מסומנת איזוטופ, מתבצעת אוטורדיוגרפיה בקלטת מיוחדת או זיהוי בשיטות לא רדיואקטיביות.

ספיגת נקודות מאפשרת לך לענות על שאלה אחת בלבד: האם רצף הנוקלאוטידים הרצוי קיים בדגימה נתונה.

ניתוח כתם צפוניחל:

1) לבודד ולנתח RNA (לדוגמה, כדי לקבוע אם mRNA שנקרא מגן נתון קיים בסוג תא נתון, כלומר האם הגן בא לידי ביטוי או לא;

2) לקבוע את כמות ה-RNA הזה ואת השינויים שלו בהתפתחות סוג תא נתון;

3) לקבוע את גודלו של תמלול של גן.

במקרה זה, מולקולות RNA מבודדות מהתא מופרדות לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל ולאחר מכן מועברות למסנן. לאחר הכלאה עם בדיקה חד-גדילית מסומנת, מזוהים אתרי ההכלאה (הומולוגיה) של ה-RNA והבדיקה.

אם רצף הנוקלאוטידים של הגן הרצוי (או ה-mRNA) אינו ידוע, אך החלבון שעל הסינתזה שלו הוא שולט ידוע, אזי ניתן לבודד כמות קטנה של חלבון טהור ולקבוע את רצף חומצות האמינו של חלק ממנו (ידע). של 5-6 שאריות חומצות אמינו מספיקות). באמצעות טבלת הקוד הגנטי, ניתן לקבוע את כל רצפי הנוקלאוטידים האפשריים בקטע של mRNA (או הגן עצמו) המקודד לרצף חומצות אמינו נתון. במקרה זה, ניתן לסנתז בדיקה כדי לחפש את השיבוטים הרצויים בספריית גנים.

ווסטרן blottinג(אימונואלקטרובלוטינג, חלבון סופג) היא שיטה לזיהוי חלבונים ייחודיים. הוא מבוסס על התופעה של אינטראקציה מאוד ספציפית של אנטיגן-נוגדנים. לפיכך, האנטיגן (המטרה) הוא החלבון הנקבע, והבדיקה היא הנוגדן אליו.

מתקבלים נוגדנים לחלבון הנבדק בדרכים שונות. הפשוטה ביותר היא להזריק דגימת חלבון מטוהרת לזרם הדם של חיית מעבדה (בדרך כלל ארנבת). גופו מייצר נוגדנים (אימונוגלובולינים) לחלבון זר זה. אלו הם נוגדנים ראשוניים שיתקשרו עם חלבון המטרה.

עם זאת, זה לא יהיה מעשי להכניס תווית זיהוי ישירות לנתוני הנוגדנים. זיהוי של חלבונים שונים ידרוש תיוג של נוגדנים שונים, דבר שיביא לעלויות גבוהות. התברר שזה סביר יותר לשימוש נוגדנים אוניברסליים – אנטי אימונוגלובולינים מצומדים, שהם בעצם נוגדנים לנוגדנים המיוצרים על ידי שימוש בחלבון המזוהה כאנטיגן. לדוגמה, אנטי אימונוגלובולינים מצומדים לארנב Ig יתקשרו עם כל האימונוגלובולינים המסונתזים בארנבות לאנטיגנים שונים. לפיכך, דווקא נוגדנים משניים אוניברסליים כאלה נושאים תווית איזוטופית או לא רדיואקטיבית. בנוסף לתווית שאינה איזוטופית, שבמהלך מספר תגובות מובילה ליצירת תרכובת צבעונית בלתי מסיסה (כמו במקרה של ספיגת חומצות גרעין), תווית כימילומינסצנטית, בעלת רגישות גבוהה יותר, היא מאוד משמש לעתים קרובות.

1) מיצוי חלבונים מההומוגנט

2) הפרדת חלבונים לפי משקל מולקולרי באמצעות SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). שיטת האלקטרופורזה SDS כוללת דנטורציה של חלבונים מקומיים. לפיכך, מולקולות חלבון בעלות משקל מולקולרי זהה יעברו באותו מסלול בג'ל ויתישרו בצורת פס. מאחר והתערובת מכילה מולקולות חלבון גדלים שונים, נוצרים פסים רבים. ניתן להמחיש את תוצאות האלקטרופורזה על ידי צביעת חלבון (כחול מבריק Coomassie, Amido שחור, צביעת כסף). לצביעת כסף יש רגישות ייחודית המאפשרת זיהוי של עד 0.1 ננוגרם חלבון ברצועה המתקבלת. זה חשוב מאוד כדי לשלוט בכמות החלבון המורחת על הג'ל.

3) העברת חלבונים מהג'ל לממברנה. הדבר נעשה מכיוון שפוליאקרילאמיד אינו מאפשר למולקולות אימונוגלובולינים גדולות להתפזר לתוך החלבון. והחלבון המשוקע על הממברנה הופך נגיש לנוגדנים. שלא כמו סופג חומצות גרעין, העברת חלבון לממברנה מתרחשת בהשפעת כוחות חשמליים, כלומר. בשדה חשמלי.

4) הכתם שנוצר מודגרת עם אנטי-סרום לחלבון, ולאחר מכן עם אנטי-אימונוגלובולינים. התוצאה מוצגת לפי סוג התווית שבה נעשה שימוש.

הגבלות:

1) הגודל הגדול של השברים הנבדקים, החורג משמעותית מאורך בדיקות ה-DNA ומונע ניתוח מולקולרי ישיר;

2) חוסר האפשרות לבחור באופן שרירותי את קצוות הרצפים הנחקרים, הנקבעים על ידי נוכחותם של אתרי הגבלה מתאימים במולקולת ה-DNA המקורית;

3) הצורך בכמות גדולה של DNA גנומי גנומי מטוהר היטב במשקל מולקולרי גבוה (לפחות 10 מיקרוגרם לכל תגובה, אשר שווה ערך ל-0.5-1 מ"ל דם),

4) עבור הכלאה גנומית - נוכחות של בדיקות DNA רדיואקטיביות עם פעילות ספציפית גבוהה של לפחות 109 פולסים/דקה * מיקרוגרם), הפועלים לפרק זמן מוגבל, ויחידת איזוטופים מאובזרת במיוחד. בנוסף, חשיפה ממושכת של חתימות מאריכה משמעותית את משך השגת התוצאות.

5) עוצמת עבודה גבוהה מֶחקָר