Koje informacije pružaju južnom mrlju. Južni blot u molekularnom genetiku. Značajke. Gledajte šta je "SARW BLOTTING" u drugim rječnicima
Ostale tehnologije prijenosa (FLEA), na primjer, zapadnjački blotting, nodern blutting, kobača za mrljanje koriste slične metode, ali za određivanje RNA ili proteina u uzorku i nazivaju se uzorak metode koju je izmislio Sarew. Budući da je južni blot nazvan imenom naučnika, izraz je napisan od velikog slova, a zapadni blot i pitkovni blot - iz malih slova.
Metoda
- Ograničenje endonukleastovima ograničenja za rezanje visokog molekularne težine DNK na manje fragmente.
- Fragmenti DNK podvrgnuti su elektroforezi u agarozni gelu za razdvajanje dužine.
- U slučaju da su neki fragmenti DNK duži od 15 KB, prije nego što prenose gel, tretira se, na primjer, hlorovodonična kiselina, koja uzrokuje DNK Deporifikaciju i olakšava prijenos u membranu.
- U slučaju kada se koristi metoda alkalnih transfera, agarozni gel nalazi se u alkalno rješenje, dok DNK dvostruki spiralni spisak denatrati i olakšava obvezujući negativno napunjene DNK s pozitivno napunjenom membranom za daljnju hibridizaciju. Istovremeno, RNA ostaci su uništeni.
- Letak nitrocelulozne (ili najlonske) membrane nalazi se na vrhu ili dno iz agarozne gela. Pritisak se vrši direktno na gelu ili kroz nekoliko slojeva papira. Za uspješan prijenos potreban je uski kontakt gela i membrane. Buffer prebacuje kapilarne sile iz područja visokog vode u vodovodnu zonu (membrana). Istovremeno, DNK se prenosi iz gela na membranu. Polianion DNK veže se na pozitivno nabijene membranske sile po interakcijama razmjene jona.
- Za konačno pričvršćivanje DNK na membrani, potonje se zagrijava u vakuu na temperaturu od 80 ° C dva sata ili osvetljenu ultraljubičastom zračenjem (u slučaju najlonskih membrana).
- Oni provode hibridizaciju radioaktivno (fluorescezno) označene uzorke s poznatim DNK sekvencom sa membranom.
- Nakon hibridizacije, višak uzoraka se oprašta iz membrane i vizualiziraju hibridizacijske proizvode autoradiografijom (u slučaju radioaktivnog uzorka) ili procijeni boju membrane (u slučaju korištenja kromogenog bojenja).
Rezultati
Uzorak hibridizacije sa specifičnim DNK sekcijom pričvršćenim na membranu ukazuje na prisustvo analiziranog nukleotidnog sekvence u uzorku.
Primjena
Southern Blutting, koji se izvodi s genomskim DNK tretiranim sa ograničenjem endonukleasta, može se koristiti za određivanje broj primjeraka gena U genomu. Uzorak koji je hibridizira samo sa jedinim fragmentom DNK koji nije rezan ograničenjima, daje jednu traku na masoutskom blotu, dok višestruka traka na blotu pokazuju da je uzorak hibridiran s nekoliko identičnih sekvenci. Promjene u uslovima hibridizacije (povećanje temperature na kojoj se provodi hibridizacija, promjena koncentracije soli) dovode do povećanja specifičnosti i smanjenja hibridizacije sa bliskim, ali ne i identičnim nizovima.
Bilješke
vidjeti i
- Mrlje
- Nosern blutting
Wikimedia Fondacija. 2010.
Gledajte šta je u drugim rječnicima "Lotting" u lopaticama:
Sarew blutting - Blotting na metodi Sarew za otkrivanje specifičnih nukleotidnih sekvenci prenošenjem elektropretetno odvojenih DNK fragmenata iz agarozne gela na nitrocellulozni (papir) filter zbog kapilarne efekta ... ...
sarew blutting - - Biotehnološka tema en Južni blotting ... Katalog tehničkih prevoditelja
sarew blutting - Južni blot uzorak DNK Južni blot. Southern Blotting uključuje elektroforetsku podjelu DNK i metode za prijenos fragmenata DNK iz agarozne gela u membranu pod djelovanjem električnog polja za daljnju analizu sa ... ... Objašnjenje engleski-Ruski Rječnik - Glosbe na nanotehnologiji. - M.
Južni blotting, Južni transfer Southern Blotting, Blotting on Sarew. Otkrivanje metoda specifičnih nukleotidnih sekvenci prenošenjem elektropretetno odvojenih fragmenata DNK iz Agarose Gel na nitrocelulozni ... ... Molekularna biologija i genetika. Rečnik.
Sarew blutting - (analiza južne blota) Identifikacijski način specifičnih DNK obrasca u ćelijama. Molekuli DNK uklanjaju se iz ćelija i uz pomoć ograničavanja enzima podijeljene su u male fragmente. Ti su fragmenti odvojeni jedan od drugog, a uz pomoć gena ... ... Objašnjenje medicine
Southern Blotting Hybridizacija s blotom sa - Southern Blotting, hibridizacija S. * Sazinn Blossy, Blot G_BOTTING PA C. * Southern Blotting ili S. Hybridizacija ili S. Gel Blot tehnologija (vidi) u kojem su se zabrani DNK odvojeni u agarozni gel ... .. .
Metoda identifikacije specifičnih oblika DNK u ćelijama. Molekuli DNK uklanjaju se iz ćelija i uz pomoć ograničavanja enzima podijeljene su u male fragmente. Ti su fragmenti odvojeni jedna od druge, a uz pomoć genetske sonde se vrši pretraga ... ... Medicinski uvjeti
Sarew Blotting Southern Blutting (sa engleskog južnog blota) Metoda koja se koristi u molekularnim biologiji za identifikaciju određenog DNK sekvence u uzorku. Metoda južne mrlje kombinira elektroforezu u agaroznoj gelu za ... ... Wikipedia
- (od engleskog blota) Opće ime molekularne biologije za prijenos određenih proteina ili nukleinskih kiselina iz otopine koji sadrže mnoge druge molekule na bilo koji nosač (nitrocelulozno membrana, pvdf ili ... ... Wikipedia
Blotting Trocting Transfer - Blotting, blotting transfer * Blossy, Blossy Perzian * Blotting ili Blot Transfer Elektroportički odvojeni postupak prenosa DNK (vidi), Fragmenti DNK, RNA, RNCFragmenti ili proteini od gela (agaroza ili poliakrilamid) na ... ... Genetika. Enciklopedski rječnik
Ostale tehnologije prijenosa (FLEA), na primjer, zapadni bluting, nodern-blot, sausestereno-blutiranje koriste slične metode, ali za određivanje RNA ili proteina u uzorku i nazivaju se prema uzorku metode koje je izmislio Sarew. Budući da je južni blot nazvan imenom naučnika, izraz je napisan od velikog slova, a zapadni blot i pitkovni blot - iz malih slova.
Enciklopedijski Youtube.
1 / 1
Južni blotting.
Titlovi
Metoda
- Ograničenje endonukleastovima ograničenja za rezanje visokog molekularne težine DNK na manje fragmente.
- Fragmenti DNK podvrgnuti su elektroforezi u agarozni gelu za razdvajanje dužine.
- U slučaju da su neki fragmenti DNK duži od 15 KB, prije nego što prenose gel, tretira se, na primjer, hlorovodonična kiselina, koja uzrokuje DNK Deporifikaciju i olakšava prijenos u membranu.
- U slučaju kada se koristi metoda alkalnih transfera, agarozni gel nalazi se u alkalno rješenje, dok DNK dvostruki spiralni spisak denatrati i olakšava obvezujući negativno napunjene DNK s pozitivno napunjenom membranom za daljnju hibridizaciju. Istovremeno, RNA ostaci su uništeni.
- Letak nitrocelulozne (ili najlonske) membrane nalazi se na vrhu ili dno iz agarozne gela. Pritisak se vrši direktno na gelu ili kroz nekoliko slojeva papira. Za uspješan prijenos potreban je uski kontakt gela i membrane. Buffer prebacuje kapilarne sile iz područja visokog vode u vodovodnu zonu (membrana). Istovremeno, DNK se prenosi iz gela na membranu. Polianion DNK veže se na pozitivno nabijene membranske sile po interakcijama razmjene jona.
- Za konačno pričvršćivanje DNK na membrani, potonje se zagrijava u vakuu na temperaturu od 80 ° C dva sata ili osvetljenu ultraljubičastom zračenjem (u slučaju najlonskih membrana).
- Oni provode hibridizaciju radioaktivno (fluorescezno) označene uzorke s poznatim DNK sekvencom sa membranom.
- Nakon hibridizacije, višak uzorka ispire se sa membranom i vizualiziraju hibridizacijsku proizvode autodiografijom (u slučaju radioaktivnog uzorka) ili procijenila membranske boje (u slučaju korištenja kromogenog bojenja).
Rezultati
Uzorak hibridizacije sa specifičnim DNK sekcijom pričvršćenim na membranu ukazuje na prisustvo analiziranog nukleotidnog sekvence u uzorku.
Primjena
Southern Blutting, koji se izvodi s genomskim DNK tretiranim sa ograničenjem endonukleasta, može se koristiti za određivanje broj primjeraka gena U genomu. Uzorak koji je hibridizira samo sa jedinim fragmentom DNK koji nije rezan ograničenjima, daje jednu traku na masoutskom blotu, dok višestruka traka na blotu pokazuju da je uzorak hibridiran s nekoliko identičnih sekvenci. Promjene u uslovima hibridizacije (povećanje temperature na kojoj se provodi hibridizacija, promjena koncentracije soli) dovode do povećanja specifičnosti i smanjenja hibridizacije sa bliskim, ali ne i identičnim nizovima.
Blotting (bukvalno - mrlje) naziva se u fragmentima makromolekula (DNK, RNA ili proteinski), odvojeni elektroforezom u gelu, na čvrstom supstratu - membrana. U studijama ljudskog gena često koriste blok zacrtavanje koji je razvio Sarew, u kojoj je oligonukleotidna sonda u rješenju, hibridizira s DNK adsorbiranjem na membrani (južna hibridizacija, hibridizacija južne mrlje, hibridizacija južne mrlje, južna mrlja). Genomic DNK (obično izoliran od leukocita ili fetalnih stanica) podijeljen je u kratke fragmente, odvojeni su u agarozni gel, prebačeni u membranu, nakon čega identificiraju određene odjeljke sa hibridizacijom s oligonukleotidnim sondama (Sl. 65.6). Ova metoda otkriva jedinstvene fragmente DNK, čija je veličina otprilike milion genoma.
Značaj metode za medicinu rezultat je mogućnosti istraživanja određenog fragmenta genomičke DNK od bilo koje osobe.
Metoda se koristi za identifikaciju velikih preuređenja u DNK i neke mutacije (većina mutacija u pokazima ne može se identificirati ovom metodom).
DNA Denaturatacija se vrši s alkalijom. Nakon završetka elektroforeze, gel se nalazi u rješenje rješenja (alkali), u kojoj DNK dva metra fragmenti gube dodir i postaju jedno-lanac.
Transfer DNK s gelom na nitrocelulozičnom ili najlonom filtru vrši se u pufernom rješenju. Izravno na površini gela postavljen je filter i hrpa filtarskog papira. Zbog kapilarne efekta, struja međuspremnika se stvara, okomito u ravninu gela. DNK je oprao iz gela odgođen filtrom i gotovo u potpunosti se pokaže da bi bio na svojoj površini. Nakon prijenosa, na filteru su fiksirane jednosmerne niti. Lokacija fragmenata na filtru tačno odgovara njihovoj lokaciji u gelu. 3. Da bi vizualno identificirali željene fragmente (fiksni DNK filter nije vidljiv), hibridiziran je nukleotidnim redoslijedom s označenim radionuklidima ili fluorescentnom naljepnicom s sintetičkim sondama oligonukleotidom (takva sonda sastoji se od 16-30 parova stolova ) ili klonirani fragment DNK. SLUČNI SOND Sonda mora biti u potpunosti ili djelomično komplementaran studijnom dijelom genomske DNK.
Prilikom inkubiranja filtra s otopinom koji sadrži označenu sondu, pojavljuje se hibridizacija komplementarnih DNK sondi i fragment na filtru. Nepouzdani molekuli za sonde opručeni su posebnim postupkom.
Radioaktivno označena područja otkrivaju se izlaganjem filtra s rendgenskim filmom (autoadiografija). Nakon manifestacije na filmu, bendovi su vidljivi s oznakom DNK sonde.
Neradactiactive naljepnice se vizualizira fluorescencijom ili indirektno koristeći antitela.
Dakle: hibridizacija južne mrlje je metoda analize strukture određenog područja genoma na osnovu:
2) razdvajanje pluralnosti fragmenata dobivenih pomoću elektroforeze u ravnom tanjuru agaroze ili drugog gela;
3) Prijenos proizvoda odvajanja na list poroznog materijala, na primjer, na nitrocelulozni filter na takav način da se svi fragmenti DNK prenose u filter i nalaze se na njemu, kreiranjem na raspodjelu fragmenata u gel nakon odvajanja;
4) hibridizacija filtra sa označenom radioaktivno ili s bojama DNK ili fragmenta RNA (uzorak), koji u nizu odgovara analiziranom dijelu genoma. Kao rezultat toga, uzorak zbog komplementarnih interakcija povezan je s onim područjima filtra, gdje se nalaze proučavani fragmenti genoma, a položaj ovih fragmenata identificira se pozicijom naljepnice iz uzorka na filtru.
I kao što je već spomenuto, uz pomoć južnog blota hibridizacije, moguće je odrediti identitet ili razliku između duljine fragmenata (polimorfizam dužina ograničenja fragmenata, RDFR) dobivenog remacijskom dijelom istog mjesta u različite poređene genome.
Da biste identificirali gen, genome DNK molekula cijeplje se restriktiktirajući enzimima u kriški od oko 15-20 hiljada parova nukleotida. Gene Split na ovaj način izložen je elektroforetskoj frakciji u agaroznoj gelu. Nakon toga, frakcija DNK-a je denaturirana grijanjem i prebacuje se iz agarozne gela na nitrocelulozni filter, gdje su imobilizirani. Proces prenosa DNK podseća na puhanje (na engleskom jeziku - blot)i nazvao metodu blotting by Sarew.Suština bluta je da se agarozni gel postavlja na filter papir navlažen u koncentriranom fiziološkom otopinu; Tada se nitrocelulozijski filter nametnuli na gelu, a papir za suhu filter postavlja se na vrh. Rješenje fiziološke otopine apsorbirano je u suhi papir; Tako da se dogodi, mora proći kroz agarozni gel, a zatim kroz nitrocelulozni filter. DNK se prenosi s otopinom, ali odgođena nitroceluloza. DNK se imobilizira na ovaj način hibridizovatina mjestu sa radioaktivnom sondom. Sa određenom sondom bit će hibridiziran samo komplementarnim fragmentima. Od radioaktivne sonde, tada se hibridizacija može otkriti pomoću autoradiografije. Svaki komplementarni niz manifestuje se u obliku radioaktivnog traka, čija se lokacija određuje veličinom fragmenta DNK. Shema metode južnog bluta prikazana je na slici. 12.4.
Sl. 12.4. Shema južnog bluta: GENOME DNK cijepanje sa ograničenjima na kriški 15.000-20000 nukleotidi parovi; Elektroforetska odvajanje ovih ograničenja u agarozni gel, prenoseći ih u nitrocelulozični filter, hibridizaciju s DNK sonde i identificirajući rezultirajuće hibridne molekule putem metode automatske metode; *) Transportna šema (blot).
Metoda za mrljanje je vrlo osjetljiva i precizna i široko korištena u forenziku, lijeku, veterinarskoj medicini. Trenutno je na primjer, molekularna hibridizacija dizajnirana za dijagnosticiranje zaraznih bolesti domaćih životinja, na primjer, za otkrivanje patogena sibirskih čirtora, bruceloze, tuberkuloze, stopala i ljuljaška, kuga svinja, ptica, enterovirusa itd. Ova metoda je "obećavajući za proučavanje plemenske kvalitete životinja. Ima prednosti studije markera proteinskih polimorfizma usvojenog danas u izboru.
Vjeruje se da se metoda hibridizacije DNK može uspješno koristiti u izboru bikova, jer se bikovski genom može podijeliti u gene koji su dalje otkriveni blutom. Istovremeno, potrebno je razlikovati oko 75 fragmenata DNK za procjenu gena na osnovu mliječne produktivnosti.
U prošle godine Razvija se nova metoda DNK analize, takozvana "genomska daktiloskopija". Genomička daktiloskopija uključuje sljedeće korake: DNK izolacija, fragmentacija pomoću enzima - ograničenja, frakcije sa elektroforezom u gelu. DNK fragmenti koji sadrže hipervarijske sekcije otkrivaju se posebnom sondom - "Jeffreys uzorci",s kojom se obvezuju putem hibridizacije. Parcele hibridizacije otkrivaju se autoradiografijom.
Studije su pokazale da se u ovoj tehnici DNK izolirani iz bakteriofaga ML3 može koristiti kao radioaktivna sonda. DNK ovog bakteriofara sadrži drugu vrstu hipervarijskog redoslijeda, koji se nalazi i u ljudskom genomu. Princip strukture ovog hipervarijskog slijeda općenito je sličan strukturi minusatellite DNK Jeffreys. Upotreba ovog novog testa za gene "Dactyloscopy" pokazala je visoku efikasnost i prikladnost za rješavanje mnogih zadataka. Činjenica je da se ove hipervarijsko sekvence nalaze iz različitih predstavnika divljih životinja - ljudi, životinje, biljaka i bakterija, a samim tim i DNK sonda Bacteriofage M13 se može široko koristiti. Na primjer, identificirati ličnost, uspostaviti srodstvo bilo kojeg živih bića. Metoda omogućava rješavanje pitanja genetike i odabira životinja, do odabira korisnih karakteristika; Pomoću ove metode moguće je generirati generičku certificiranje pojedinih visokoproduktivnih životinja, analizira rodovnik i dobivene informacije za upotrebu za odabir usmjerenja.
Postoji još jedna vrsta analize DNK hibridizacije - to je metoda hibridizacije tačke (tačke) (Sl. 9), koja se izvodi tako da proučavani DNK uzorci DNK u denaturiranom stanju u obliku bodova u obliku bodova. Na primjer (Sl. 12.5), DNK mikobakterijske tuberkuloze goveda u iznosu od 3 μl (1,8 μg / ml) u obliku točaka primjenjuje se na kvadrat (1,5 x 1,5 cm).
Sl. 12.5. Dot-hibridizacija DNK sonde M.BOVIS: A: 1 - M.BOVIS: 2.3, - DNK pogođenog tuberkuloze tkiva; P: 1,2,3 - DNK izolirana od zdravih životinjskih tkiva; C: 1 - DNK kaurodalnog agenta Brucellize;
2 - DNK uzročnika zalogaja;
3 - DNK M. Fortuitum.
Jednostavni molekuli DNK (denaturirani) su adsorbirani na membrani i fiksni. Nakon toga na filter se primjenjuje DNK sonda, označena radioaktivnim fosforom, odnosno jednočasni molekula M.BOVIS, označen P 32. Budući da su u ovom slučaju dušične baze molekula M.BOVIS DNK i označene P 32 DNK sonda, obvezuju se na azogene baze DNK niti i DNK sonde s formiranjem dvostruke spirale. Nakon toga, nepovezane molekule DNK sonde su opružene, a rezultirajuće hibridne molekule otkrivaju radioutopho.
Nakon DNK, RNA ili proteini su odvojeni, moraju se prenijeti na čvrstu podlogu za otkrivanje i druge operacije koje su u gelu s poteškoćama. Proces prenosa koji vodi do imobilizacija molekula . pričvršćivanje u fiksnom stanju, nazvano mrlje (na engleskom. - mrlje ). Najlonske ili nitrocelulozne membrane koriste se kao supstrat.
Mrlje (Iz engleskog bluta - blutting) je metoda prenošenja fragmenata elektroforetske DNK na poseban film (membrana) iz nitroceluloze, obvezujući (imobiliziranje) DNK molekula s jednim lancem.
Sarew blutting (Prema nazivu svog autora), zasnovan je na kretanju fragmenata DNK zbog kapilarnog efekta. Proces prijenosa fragmenata DNK, koji se nalazi u agarozni gel, na filmu iz nitroceluloze koristeći filter papir sličan je mrlje.
Analiza se vrši na sljedeći način:
- Odabrani, pročišćeni, denaturirani i podijeljeni u fragmente DNK postavljeni su na list agarozne gela, gdje se događa elektroforetska odvajanje fragmenata masom i naplatom.
- Agarozni list gela postavljen je na filter papir navlažen koncentriranom otopinom sa slanom otopinom (međuspremnika).
- Tada se na gel nanosi nitrocelulozni filter na gel, gdje se pojavljuju imobilizacija (ili adsorpcija ili fiksacija) bračnih fragmenata DNK-lanaca.
- preko filtera primjenjuje se na snop listova papira suhih filtera, koji pruža sporu struju pufernog rješenja kroz gel (I.E. služi kao osebujna kapilarna pumpa). Saline, prolazeći kroz agarozni gel, nosi fragmente DNK, koji odgađaju nitrocelulozni i vežu se, a rješenje apsorbuje papir za suve filter.
- Nadalje, DNK je denaturiran od Alkalija, a filter se čuva u vakuu na temperaturi od 80 0 s, kao rezultat toga što su bračni fragmenti sa jednim lancem nepovratno imobilizirani (fiksirani) na nitrocelulozu. Istovremeno, lokacija imobiliziranih DNK bendova tačno odgovara njihovoj lokaciji u gelu.
- DNK povezan s filtrom smješten je u otopinu s oznakom DNK sonde u kojoj se događa hibridizacija. Bit će hibridizirana (kovanje vodikovnih veza) s određenom sondom bit će samo komplementarni fragmenti DNK koji se mogu otkriti kao svjetlosne trake na rendgenskom filmu, I.E. RadioAutogram nitrocelulozni filter
Tački blut. Za pripremu Dot-Blotova, DNK ili RNA primjenjuju se direktno na filter. Kapi lijeka izgleda u obliku točaka na filtru, koji objašnjava naziv vrste blota (eng. Dot-oho). 1) Od genomičke DNK unaprijed tretirane ultrazvukom, formiraju se fragmenti 5-10 pari nukleotida.
2) Da biste napravili DNK ili RNA uzorke dostupnim sondi, trebaju biti denaturirani, i.e. Prevesti u jedan nasučeni oblik. To se događa pod utjecajem temperature od 100 ° C.
3) Denaturirane nukleinske kiseline se inkubiraju na ledu: brzo smanjenje temperature sprečava ih od renacionarne, I.E. Komplementarni lanci uparivanja. Denaturizirani DNK ili RNA primjenjuju se direktno na filter koji se inkubira u rješenju koja sadrži sondu.
4) Da bi se analizirana nukleinska kiselina nije prebačena na rješenje, mora se popraviti na filtru (membrana). Za to koriste se dvije vrste filtera: nitrocelulozic i najlon.
Za imobilizaciju nukleinskih kiselina na nitrocelulozičnom filtru, podešavanje se koristi na 80 ° C u vakuu, a na najlonom filtru - UV zračenje 3-5 minuta.
5) Nakon inkubacije lijeka nukleinske kiseline s označenim izotopom, sonda se izvodi sa radioautografijom u posebnoj kaseti ili identifikaciji ne-radioaktivnim metodama.
Dot bluting omogućava vam da odgovorite na samo jedno pitanje: Da li je u ovom uzorku željenog niza nukleotida.
Analiza nodernog-blota Korišteno:
1) izolirati i analizirati RNA (na primjer, otkriti je li u ovoj vrsti MRNA ćelija čitati iz ovog gena, I.E. Gene je izražen ili ne;
2) odrediti broj ovog RNA i njegove promjene u razvoju ove vrste ćelija;
3) Da biste odredili veličinu transkripta nekog gena.
U ovom slučaju, molekuli RNA izolirani iz ćelije odvojeni su veličine pomoću gel elektroforeze, a zatim se prebacuju u filter. Nakon hibridizacije s oznakom jednosmjernom sondom, otkrivena su mjesta hibridizacije (homologija) RNA i sonde.
Ako je nukleotidni niz željenog gena (ili MRNA) ne zna, ali protein je poznat, sinteza o kojoj se može razlikovati mala količina čistog proteina kako bi se odredio niza aminokiseline nekog dijela dio IT (dovoljno znanje 5-6 ostataka aminokiselina). Upotreba genetske kodne tablice možete postaviti sve moguće nukleotidne sekvence u sekciji MRNA (ili samim genom), koji kodiraju ovu srednju sredstva aminokiselina. U ovom slučaju možete sintetizirati sondu za traženje željenih klonova u biblioteci gena.
Zapadni Blotting.(Imunoelectroblotting, proteinski bluting) je metoda za identifikaciju jedinstvenih proteina. Temelji se na fenomenu visoko specifične antigene za interakciju. Dakle, antigen (cilj) je definirani protein, a sonda je antitijelo za to.
Antitijela na proučarene proteine \u200b\u200bdobivaju se na različite načine. Najjednostavniji je uvođenje oguljenog uzorka proteina na krvotok laboratorijske životinje (obično zec). Njegov organizam proizveo je antitijela (imunoglobulins) u ovaj vanzemaljski protein. Ovo su primarna antitijela koja će komunicirati sa ciljanim proteinima.
Međutim, ne bi bilo racionalno ući u oznaku da se direktno identificira na antitijelovne podatke. Da bi se utvrdili različiti proteini, bilo bi potrebno napraviti različite antitijele, što bi dovelo do njihovih visokih troškova. Ispostavilo se razumnije za upotrebu univerzalna antitijela – konjugirani anti-imunoglobulinovTo su, u stvari, antitela na antitijela razvijene prilikom korištenja identifikacijskog proteina kao antigena. Na primjer, konjugirani anti-emunoglanini za iG zec komunicirat će sa svim imunoglobulinama sintetiziranim od zeca za različite antigene. Stoga je takva univerzalna sekundarna antitijela koja nose izotopnu ili ne-razvojnu etiketu. Pored etiketa sa nekompunjakom, koja tokom niza reakcija dovodi do formiranja netopljive obojenog spoja (kao u slučaju blokiranja nukleinskih kiselina), hemiluminecentna etiketa ima veću osjetljivost koja ima veću osjetljivost.
1) Ekstrakcija gomogeneratskih proteina
2) odvajanje proteina u molekularnim masama uz pomoć elektroforeze SDS-a u poliakrilamidnom gelu (PAAG). Metoda elektroforeze SDS-a podrazumijeva denaturaciju izvornih proteina. Dakle, molekuli proteina s istim molekularna težina proći će u gel istim putem i postrojen u obliku trake. Budući da su molekuli proteina prisutni u smjesi. različite veličineFormira se više traka. Vizualizirajte rezultate elektroforeze mogu se obojiti proteinom (Cumassi dijamantni plavi, amido crni, srebrni boje). Srebrno bojenje ima jedinstvenu osjetljivost koja vam omogućava da odredite cijeli 0,1 NG protein u rezultirajućoj traci. Ovo je vrlo važno za kontrolu količine proteina koji se primjenjuje na gel.
3) prenos proteina iz gela na membranu. To se učini jer poliakrilamid ne difuzuje za difuziju velikih imunoglobulina molekula na protein. A protein imobiliziran na membrani postaje pristupačna antitijela. Za razliku od blokiranja nukleinskih kiselina, prijenos proteina na membrani javlja se pod utjecajem električnih sila, I.E. U električnom polju.
4) Rezultirajuće blotsu se inkubiraju sa antiserumom u protein, a potom i sa antiponoonobulin. Rezultat se vizualizira u skladu s vrstom oznake koja se koristi.
Ograničenja:
1) veliku veličinu proučavanih fragmenata, značajno superiorna dužina DNK sondi i sprečavanje izravne molekularne analize;
2) nemogućnost proizvoljnog izbora krajeva proučanih nizova koja se određuju prisutnošću relevantnih ograničenja u originalnom molekuli DNK;
3) potreba za velikim brojem dobro pročišćenih visokih molekularne težine genomski DNK (najmanje 10 μg po reakciji, koji je jednak 0,5-1 ml krvi),
4) Za genomičku hibridizaciju - prisustvo radioaktivnih DNK sondi sa visokom specifičnom aktivnošću od najmanje 109 IMP. / Min * μg), ograničeno vreme i posebno opremljenu izotopsku jedinicu. Pored toga, dugo izloženost autografa značajno produžuje vrijeme dobivanja rezultata.
5) veliki intenzitet rada istraživanje